食品检验技术之蛋白质和氨基酸的测定

1、测定蛋白质含量的方法：

    凯氏定氮法

    快速测定法（双缩脲、紫外、水杨酸比色、染料结合法）

2、测定氨基酸的方法：

    甲醛、电位滴定、茚三酮比色

    气相、液相、薄层、离子交换色谱

    自动分析仪

1、实验原理

    以硫酸铜为催化剂，用浓硫酸消化试样，使有机氮分解为氨，与硫酸生成硫酸铵。然后加碱蒸馏使氨逸出，用硼酸溶液吸收，再用盐酸标准溶液滴定。根据盐酸标准滴定溶液的消耗量计算蛋白质的含量。

2、实验步骤

（1）试样的制备与称样（称0.5-5g试样（含氮30-40mg） 放入凯氏烧瓶中）。

（2）消化

    向凯氏烧瓶中依次加入硫酸铜0.4g、硫酸钾10g、硫酸20mL。将凯氏烧瓶放在电炉上，缓慢加热。待起泡停止，内容物均匀后，升高温度，保持液面微沸。当溶液呈蓝绿色透明时，继续加热0.5-1h。取下凯氏烧瓶冷却至约40℃，缓慢加人适量水，摇匀，冷却至室温。 

（3）蒸馏与吸收

    将消化好并冷却至室温的消化溶液全部转移到100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀。

    向接收瓶内加入30mL2%硼酸溶液和1滴混合指示剂。将接收瓶置于蒸馏装置的冷凝管下口，使下口浸入硼酸溶液中。取 10±0.05mL稀释定容后的试液，沿小玻璃杯移入反应室。并用少量水冲洗小玻璃杯，一并移入反应室。塞紧棒状玻璃塞，向小玻璃杯内加入约10mL40%氢氧化钠溶液。提起玻璃塞，使氢氧化钠溶液缓慢流入反应室。立即塞紧玻璃塞，并在小玻璃杯中加水，使之密封。通入蒸汽，蒸馏5min。降低接收瓶的位置，使冷凝管管口离开液面，继续蒸馏1min。用少量蒸馏水冲洗冷凝管管口，洗液并入接收瓶内。取下接收瓶。

（4） 滴定

    用0.1mol/L盐酸标准滴定溶液滴定收集液至刚刚出现紫红色为终点。

    同一试样做两次平行实验，同时做空白实验。

3、结果计算   

             （V0 / V）×0.014×c

X(%) =----------------------------×F×100

                   m×(10/100)

    为满足生产过程的快速控制分析，减少环境污染、简便操作省时，建立了快速测定方法；

    如：双缩脲法、紫外分光光度法、水杨酸比色法、染料结合法。

1、双缩脲法

（1）原理：双缩脲在碱性条件下，能与硫酸铜结合生成红紫色络合物。蛋白质中含有肽键，与双缩脲结构相似，也呈此反应。在一定条件下其颜色深浅与蛋白质含量成正比；λmax=560nm可用吸收光度法进行比色测定。

（2）测定

①标准曲线绘制

    以采用凯氏定氮法测出蛋白质含量的样品作为标准蛋白质样，按蛋白质含量40、50、60、70、80、90、100、110mg称取样品8份于纳氏比色管中，各加入1mlCCl4（阻滞淀粉、还原糖、色素、类脂物溶解，，消除干扰）加入双缩脲试剂（酒石酸钾钠，KOH ，CuSO4）50.00ml振摇均匀（10min）静置1h，取上层清液离心5min，再测λmax=560nm时的A（水作参比）。

②样品测定

    准确称取适量样品，同样方法测样品的A。

（3）计算        

蛋白质（％）= (X/W)×100

x——从标准曲线中查得蛋白质含量，mg

w——测定样液相当样品质量，mg

（4）说明

①高脂肪样品，先用醚抽出弃之。

②若有不溶物可抽出蛋白质后再测。

2、水杨酸比色法

（1）原理: 样品中蛋白质经硫酸消化后转变为铵盐，与水杨酸钠作用生成蓝色化合物，在λmax=660nm处比色测定，求出含氮量，计算蛋白质％。

（2）测定:①标准曲线  吸取含氮2.5μg/ml的硫酸铵（NH4）2SO4标准溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml置于25ml容量瓶中，分别加入：空白酸溶液2ml、磷酸盐缓冲液5ml、加水至15ml、水杨酸钠5ml、36～37℃恒温水浴15min，加入次氯酸钠2.5ml,再在36～37℃恒温15min，加水至刻度, λmax=660nm测A。 ②样品处理：称取0.2～1.0g置于凯氏烧瓶中，加入15ml浓H2SO4，0.5gCuSO4，4.5g无水硫酸钠，小火加热沸腾后，进行消化，待溶液澄清，呈暗绿色时，冷却，移至250ml容量瓶中，定容。③样品测定：吸取样液5ml（必要时稀释）以下步骤同上“标准曲线”操作 。

（3）计算

蛋（％）= 总氮（％）×F（6.25）

X--含氮量μg，k--样品稀释倍数，m--样品质量，g。

（4）说明：①消化样品，当天测定，重现性好。②严格控制反应温度（36～37℃），因为影响显色。

1、双指示剂甲醛滴定法（测定游离氨基酸）

有单指示剂滴定法、双指示剂滴定法。

单指示剂有：百里酚酞,酚酞。双指示剂有：中性红—百里酚酞。

其原理均是用甲醛与NH2作用，使碱性消失，再用强碱滴定COOH。

测定：①样品（溶液）（20—30mg氨基酸+H2O+3滴中性红，用0.1N NaOH滴定至黄橙色 （V1）②样品+中性甲醛+3滴百里酚酞，摇，静1min，用0.1N NaOH滴定至淡蓝色 （V2）。

计算：                    

氨基酸态氮（%）= [（V2－V1）×C×0.014]/W*100

式中：V1——用中性红作指示剂滴定时消耗氢氧化钠的体积,V2——用百里酚酞作指示剂滴定时耗氢氧化钠的体积。

2、电位滴定法

（1）原理：加入甲醛，固定氨基碱性。用酸度计指示滴定终点，据加入甲醛后耗用NaOH量计算蛋白质％。

适用于混浊及色深样品的直接滴定。

（2）测定：①样液用NaOH滴定至pH=7.5～8.2。

②加入中性20％甲醛后，用NaOH滴至pH=9.2。

③同时作空白试验。

（3）计算：

3、茚三酮比色法

（1）原理

氨基酸在碱性溶液中能与茚三酮作用生成蓝紫色化合物，λmax=570nm其颜色深浅与氨基酸含量成正比。

（2）测定

①准确吸取100μg/ml氨基酸标准溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0ml至比色管中，补加水至相同体积。加入茚三酮、磷酸缓冲液各1ml，水浴中加热15min。加水至（或转入容量瓶中）25ml，静置15min。在570nm下以空白液为参比液，测A，绘制标准曲线。

②样品测定

吸取样液1～5ml，用同样条件下测A，查出氨基酸μg。

（3）计算

                                                 X

氨基酸总量（mg％）= ---------------×100

                                          m×1000

 例：游离赖氨酸的测定

①原理

赖氨酸与茚三酮在pH＜3的专一显色反应，在λ=475nm处测A，分析范围=0.075～0.2mg/ml。

②测定

a 标准曲线

   在试管中分别加入赖氨酸标准溶液（0.2mg/ml）0.75、1.0、1.25、1.5、1.75、2.0ml各补足至2.0mL，加入4mL茚三酮试剂, λ=475nm处，测A。

b 待测液测定

 吸取待测液2ml，加4mL茚三酮试剂，λ=475nm,测A

（茚三酮试剂——茚三酮1.25g+94mL乙二醇甲醚；+CuCl2·2H2O 1.7g + 32mL0.1M柠檬酸）。