生活饮用水中微生物的检测方法
前言
生活饮用水中微生物的检测依据：
GBT5750.2-2023《生活饮用水标准检验方法 水样的采集和保存》
GBT5750.12-2023《生活饮用水标准检验方法 微生物指标》
本文主要包含：
1.生活饮用水中的微生物指标
2.水样采集规则及注意事项
3.菌落总数、总大肠菌群、大肠埃希氏菌的测定方法
4.对所检测水样的综合分析
生活饮用水中的微生物指标
项目 | 单位 | 限值 | 说明 |
总大肠菌群 | MPN/100mL或 CFU/100mL | 不得检出 | 一般性污染 |
大肠埃希氏菌 | MPN/100mL或 CFU/100mL | 不得检出 | 指示粪便污染 |
菌落总数 | MPN/100mL或 CFU/100mL | 100 | 一般性污染 |
菌落总数
1mL水样在营养琼脂培养基上,在有氧条件下36℃士l℃培养48h后，所得1ml水样中的菌落总数。
检测意义：作为一般性污染的指标,即评价被检样品的微生物污染程度和安全性。水样菌落总数越多，说明水被微生物污染程度越严重，病原微生物存在的可能性越大，但不能说明污染的来源。
总大肠菌群
指一群在36℃士1℃培养24h能发酵乳糖，产酸产气，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。 检测意义：作为粪便污染的指标。水样总大肠菌群的含量,表明水被粪便污染的程度，而且间接地表明有肠道致病菌存在的可能。
一、水样采集
采样原则：所采集的样品具有代表性。
采样容器:不能是新的污染源:不吸收或吸附某些待测组分不与待测组分发生反应。保证从采样到分析期间样品各组分的浓度不发生改变。
微生物样品必须按一般无菌操作的基本要求采集,并保证在运送、贮存过程中不受污染。
自来水水样:先将自来水龙头用火焰烧灼3min灭菌再开放水龙头使水流5min(经常用水的水龙头放水1~3min)后，采集水样于无菌玻璃瓶,约占瓶容量80%，以便摇匀水样。
水源水水样:选有代表性的地点及可疑地方,一般距水面下10-15cm采集，采样后在水中改好盖子，再从水中取出。
注意事项：
1.严格无菌操作。
2.做好标记:采得水样后应立即记录水样名称、地点、时间等内容。
3.从速送检。水样从采集到检验不应超过2h,在0~4℃下保存不应超过24h。
二、菌落总数测定-平皿计数法
所需培养基和试剂：营养琼脂、9mL无菌生理盐水管。
自来水水样检测
操作步骤：
1.以无菌操作方法用灭菌吸管吸取1mL充分混匀的水样,注入灭菌平皿中。
2.倾注约15mL已融化井冷却到45℃左右的营养琼脂培养基,并立即旋摇平皿,使水与培养基充分混匀（每次检验时应做一平行接种,同时另用一个平只倾注营养琼脂养基作为空白对照）
3.待冷却凝固后,翻转平皿,使底面向上,置于36℃±1℃培养箱内培养48h±2h,进行菌落计数,即为水样1mL中的菌落总数。
4.培养完成后，用眼睛直接观察,必要时用放大镜检查,以防遗漏。
实验数据处理:
若菌落数在100以内时按实有数报告，大于100时，采用两位有效数字，在两位有效数字后面的数值，以四舍五入方法计算，为了缩短数字后面零的个数也可用10的指数来表示(见表1)。
国家标准(GB5749-2022)规定生活饮用水菌落总数每毫升不得超过100个。
水源水检测
操作步骤：
1.以无操作方法吸取1mL充分混匀的水，注入盛有9mL灭菌生理盐水的试管中，混匀成1:10稀释液。
2.吸取1:10的稀释液1ml，注入盛有9mL灭菌生理盐水的试管中,混匀成1:100稀释液，按同法依次稀释成1:1000，1:1000释液等备用（如此递增稀释一次,必须更换一支1mL灭菌管）。
3.然后用无菌极管取稀释的水样和2个~3个适释度的水样1mL，分别注入灭菌平皿内。之后操作同自来水水样的检验步骤。
试验数据处理: 计算平均菌落数，首先选择平均菌落在30~300之间者进行计算。 计算方法和报告方式： 一般水源水中菌落总数与水清洁程度的关系： 水的类别 最清洁水 清洁水 不太清洁水 不清洁水 极不清洁水 菌落总数CFU/100mL 10-100 100 -1000 1000 -10000 10000 -100000 > 100000
注意事项： 1.菌落总数测定中，应选择合适的稀释度进行(生活饮用水，国家标准规定每毫升不得超过100个，因此以直接吸取1毫升到平板进行培养) 2.各稀释管、相应半皿做好标记。包括:水样名称、稀释度、时间、小组。 3.严格无菌操作进行水样稀释时，每一稀释度均需更换吸管。 4.倾注时，要注意营养琼脂的温度。 5.倾入琼脂后要混匀，待琼脂凝固后倒置培养。
三、总大肠菌群测定
所需培养基和试剂：乳糖蛋白胨培养液、双料乳糖蛋白胨培养液、伊红美蓝培养基。
多管发酵法步骤:
初步发酵试验: 采用乳糖蛋白培养液36℃±1℃培养18-24h观察产酸产气情况。 平板分离: 将产酸产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，于36 ℃士1℃培养箱内培养18 h~24 h,观察菌落形态,挑取符合下列特征的菌落进行革兰氏染色镜检: --深紫黑色.具有金属光泽的菌落﹔ --紫黑色、不带或略带金属光泽的菌落﹔ --淡紫红色、中心较深的菌落。 复发酵证实试验: 经上述染色镜检为革兰氏阴性无芽孢杆菌,同时接种乳糖蛋白豚培养液,置36 ℃士1℃培养箱中培养24h士2h,有产酸产气者,即证实有总大肠菌群存在。 结果报告(MPN): 根据 GB5750.12-2022 所附检索表报告结果。
初发酵、复发酵试验结果
大肠菌群在EMB平板上的典型特征 
大肠菌群革兰氏染色镜检结果
四、耐热大肠菌群测定
所需培养基和试剂：乳糖蛋白胨培养液、EC肉汤、伊红美蓝培养基
多管发酵法步骤:
初步发酵试验:
采用乳糖蛋白培养液36℃±1℃培养24h观察产酸产气情况。
耐热培养:
阳性管接种在EC肉汤管中，44.5℃培养24h观察产酸产气情况。
平板培养:
阳性管接种在EMB平板上，36℃±1℃培养24h。
结果报告(MPN):
根据 GB5750.12-2023 所附检索表报告结果。
不同细菌在EC肉汤中的生长特征 
五、大肠埃希氏菌测定
所需培养基和试剂：EC-MUG培养基
多管发酵法步骤:
耐热培养:
将总大肠菌群初发酵中产酸或产气的管进行大肠埃希氏菌检测，接种此类试管中的液体到EC-MUG管中，在培养箱或恒温水浴中44.5℃培养24h。如使用恒温水浴，在接种后30min内进行培养，使水浴液面超过EC-MUG管的液面。
结果报告(MPN):
将培养后的EC-MUG管在暗处用366nm紫外灯照射，如有蓝色荧光，则表明水样中含有大肠埃希氏菌。
计算EC-MUG阳性管数，根据 GB5750.12-2023 所附检索表报告结果。
不同细菌在EC-MUG管中的生长特征
生活饮用水中微生物检测方法总结
